TESTES IMUNOLÓGICOS: ELISA

O que são os testes imunológicos?

Os testes sorológicos são métodos capazes de detectar e quantificar os anticorpos ou antígenos, podendo utilizar reagentes marcados ou não marcados.

Os ensaios de precipitação e aglutinação, caracterizam as técnicas com reagentes não marcados. Esses métodos apresentam uma menor sensibilidade de detecção, pois é necessário que ocorra a formação de grande quantidade de complexos de antígeno-anticorpo para que essas moléculas sejam visualizadas. Já os ensaios realizados com marcadores radioativos, ou enzimáticos, ou fluorescentes ou de quimioluminescência possuem maior sensibilidade, uma vez que os sistemas de marcação amplificam o sinal final, facilitando a detecção.

ELISA

O ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) é um teste sorológico imunoenzimático capaz de detectar quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos através de reações enzimáticas. É um método heterogêneo que possui diversas etapas. Nesse teste um dos reagentes é imobilizado em uma fase sólida, que normalmente é uma placa de plástico, enquanto o outro reagente pode ser ligado a uma enzima. Após a realização de cada etapa, a lavagem da placa ocorre para remover qualquer material que não esteja ligado à fase sólida. A presença dos antígenos ou dos anticorpos é revelada pela produção de cor com a adição do substrato da enzima e de uma substância cromógena, indicando uma reação positiva.

O teste de ELISA apresenta alta sensibilidade, detectando quantidades mínimas do alvo pesquisado, dessa forma, possuem menos resultados falsos negativos. Também apresentam alta especificidade, apresentando uma boa precisão dos resultados, consequentemente, possuem menos resultados falsos positivos. É um teste rápido, fácil de ser realizado e com custo baixo a moderado, quando comparado com outros testes.

Como as substâncias medidas nem sempre são as mesmas, diferentes tipos de ELISA foram desenvolvidos, sendo que os principais são: ELISA direto, indireto e sanduíche.

TIPOS DE ELISA

1. ELISA DIRETO

É a forma mais simples do ELISA. Nesse teste antígenos são adicionados na placa de plástico e eles se ligam na sua superfície. É realizada uma primeira lavagem para retirar os antígenos que não se ligaram. Em seguida, ocorre a colocação da amostra a ser pesquisada contendo anticorpos marcados com a enzima. Uma nova lavagem é realizada para retirar os anticorpos da amostra que não se ligaram. Por fim o substrato da enzima é adicionado e se o cromógeno for oxidado pela enzima, haverá uma mudança de cor, mostrando que o resultado do teste foi positivo.

2. ELISA INDIRETO

É um método indireto, pois nesse caso ocorre a participação de um anticorpo secundário. Nesse teste antígenos são adicionados na placa de plástico e eles se ligam na sua superfície. É realizada uma primeira lavagem para retirar os antígenos que não se ligaram. Em seguida, ocorre a adição da amostra e a placa é incubada. Durante a incubação, imunocomplexos podem ser formados, caso os anticorpos da amostra sejam específicos para os antígenos da placa. Uma nova lavagem é realizada para retirar os anticorpos da amostra que não se ligaram. Para que essa reação seja visualizada ocorre a adição de um anticorpo secundário marcado com uma enzima que reconhece o anticorpo do complexo antígeno-anticorpo formado previamente. Outra lavagem é realizada para retirar os anticorpos marcados com a enzima que não se ligaram. Por fim o substrato da enzima é adicionado e se o cromógeno for oxidado pela enzima, haverá uma mudança de cor, mostrando que o resultado do teste foi positivo.

3. ELISA SANDUÍCHE

Nesse teste anticorpos de captura são adicionados na placa de plástico e eles se ligam na sua superfície. É realizada uma primeira lavagem para retirar os anticorpos que não se ligaram. Em seguida, ocorre a adição da amostra e a placa é incubada. Durante a incubação, imunocomplexos podem ser formados, caso os antígenos da amostra sejam específicos dos os anticorpos de captura da placa. Uma nova lavagem é realizada para retirar os antígenos da amostra que não foram capturados. Na próxima etapa anticorpos marcados com a enzima específica do antígeno são adicionados e a placa é submetida a uma nova incubação. Outra lavagem é realizada para retirar os anticorpos marcados com a enzima que não se ligaram. Por fim o substrato da enzima é adicionado e se o cromógeno for oxidado pela enzima, haverá uma mudança de cor, mostrando que o resultado do teste foi positivo. O método é chamado de sanduíche, pois a molécula relevante fica entre duas moléculas de anticorpo.

REFERÊNCIAS

LIN, Alice V. Direct ELISA. In: ELISA. Humana Press, New York, NY, 2015. p. 61-67.

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